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表达载体上的各种常用蛋白标签

(时间:2017-10-20 10:07  来源:必拓网   作者:admin   点击:次)
蛋白标签(protein tag)是指与目的蛋白一起融合表达的一段多肽(包括小肽)或者蛋白,其作用是便于目的蛋白的表达、纯化、检测和示踪等。过去数十年,研究人员相继发现和开发出了具有各种不同功能的蛋白标签,已在基础研究和产业化产品生产等方面得到了广泛的应用。

实际上,任何一个蛋白或多肽只要其具有促进表达、便于纯化或检测等功能,都可以成为另一个蛋白或多肽的标签(或标签蛋白)。所以文献报道可以当做标签使用的蛋白或多肽超过数百种之多。但是,根据使用的广泛程度和通用性衡量,常用的蛋白标签并不多。如上文所述,标签蛋白有多种多样的用途,本文将仅就有利于表达和纯化的标签进行简单介绍,希望对大家在表达和制备外源蛋白时有所帮助。


(一)便于纯化的标签

这类标签一般对外源蛋白的表达没有明显影响,主要是便于纯化和蛋白的检测。这类标签首推多聚组氨酸标签, 通常是6个组氨酸残基构成的小肽,此外,还有Strep tag标签及其改进型StrepII tag也应用较为广泛。

1.His6 tag

常用的是6个连续的组氨酸残基(His6)构成的小肽,一般6-10残基都可以使用,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点:

1)标签的分子量小,只有~0.84KD,一般不影响目标蛋白的功能;

2)His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性;

3)His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

4)可应用于多种表达系统,纯化的条件温和;

5)可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

2.Strep tag和StrepII tag

前者长38个氨基酸残基,后者是其突变改进形式,长8个氨基酸残基。前者用链亲和素(Streptavidin)偶联的层析柱纯化,后者用改进型的链亲和素(Strep-Tactin)偶联的亲和层析柱纯化。它们的结合力和结合特异性都非常不错,应用较为广泛。


(二)促进表达的标签

这类标签主要具有促进与之融合的目的蛋白表达的作用,基本上都具有分子伴侣或折叠酶的功能。

1.二硫键形成相关蛋白类(Dsb)蛋白标签

主要有DsbA、DsbC和DsbG蛋白,后两者更为常用。这是一类在大肠杆菌蛋白折叠过程中发挥辅助功能的蛋白质,能促进二硫键的正确形成,都具有很强的分子伴侣功能,可以促进外源蛋白的表达,且能促进外源蛋白可溶表达。

2.FkpA类蛋白标签

FkpA为大肠杆菌肽酰脯氨酰顺反异构酶,在蛋白翻译折叠过程中发挥重要作用,也具有很强的分子伴侣效应。可促进外源蛋白以可溶形式高效表达。

3.SUMO标签

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-like modifier),是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣,不但可以提高融合蛋白的表达量,且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠,提高重组蛋白可溶性等功能。

SUMO标签还有一项重要的特点,就是可用于完整地切除标签蛋白,得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶能识别完整的SUMO标签蛋白序列,并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后,经过亲和层析,去除标签蛋白部分,就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用,作为特异酶切水解位点。

4.NusA(N-utilization substance A)蛋白

NusA蛋白是文献报道在大肠杆菌中促进外源蛋白表达能力最强的标签蛋白之一。

这类标签蛋白还有很多种,它们促进表达的效果也有一些差异,而且针对不同蛋白,不同的标签蛋白的促表达作用也不尽相同,需要通过表达实验来验证。


(三)同时具有促进表达和便于纯化的标签

这类标签也包含多种,一般都能不同程度促进蛋白的表达,而且也有相对应的纯化方法,可以进行一步纯化。

1. MBP(麦芽糖结合蛋白)标签

MBP标签蛋白大小为40kDa,由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。

纯化:融合蛋白可通过交联淀粉(Amylose)的亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合,而其他融合蛋白则不受影响。 缓冲条件为pH7.0到8.5,盐浓度可高达1M,但不能使用变性剂。

2.GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签

GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶,它的天然大小为26kD。GST有两个特点,一个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用;另一个是它是一个高度可溶的蛋白,利用它增加外源蛋白表达的可溶性。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达,可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在多数情况下,融合蛋白在水溶液中是可溶的。

纯化:该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和介质进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如:盐酸胍或尿素等。

3. Calmodulin-binding peptide(钙调蛋白结合肽,CBP)标签

CBP由26个氨基酸残基组成,有一定的促表达效果,但主要是可以用来做亲和纯化。将钙调蛋白偶联在琼脂糖凝胶介质上,能非常特异的纯化CBP融合蛋白,洗脱条件为温和的钙离子缓冲液。

4. Chitin-binding domain(几丁质结合域,CBD)

CBD由51个氨基酸残基构成,有一定的促表达效果,但主要也是用来做融合蛋白的亲和纯化。将几丁质偶联在层析介质上就得到了CBD亲和层析介质。可以一步纯化CBD融合蛋白,然后用几丁质或其类似物溶液竞争洗脱就能将融合蛋白洗脱下来,洗脱条件也很温和。


(四)便于检测的标签

这一类标签的主要作用是提供一类检测与之相融合的目的蛋白的便捷方法,如果有针对这些标签的特异抗体,这些标签也可应用于目的蛋白的亲和纯化。

1.Flag标签蛋白

Flag标签为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),其融合表达目的蛋白后具有以下优点:

1)作为融合表达标签,Flag通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

2)融合在N端的Flag,可以被肠激酶切除(DDDK),从而得到特异的目的蛋白。因此Flag标签现已广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

3)易于用Anti-Flag的抗体进行检测。

2.HA标签

HA标签蛋白,序列为YPYDVPDYA的9个氨基酸残基多肽,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇,对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti-HA的抗体进行检测。

3.c-Myc标签

C-Myc 标签蛋白,是一个含10个氨基酸残基的小标签,标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,这10个氨基酸残基作为抗原表位表达在不同的蛋白质中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中,可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

4.Avi Tag

Avi Tag标签蛋白是一个15个氨基酸残基组成的短肽,具有一个单生物素化赖氨酸位点,与已知天然可生物素化序列完全不同,可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后,可被生物素连接酶生物素化。为了纯化重组蛋白,选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物,除了用于蛋白质分离纯化,还用于蛋白质相互作用研究。Avi Tag标签系统具有以下几大优点:

1)无论在体外或者体内,几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化;

2)生物素化是通过酶和底物的反应来实现,反应条件相当温和而且标记的专一性极高;

3)生物素Avi Tag只有15个氨基酸,对蛋白空间结构的影响非常小;

4)生物素与链亲和素具有很高的很专一的结合活性,非常便于后期检测。


(五)标签的切除

一般为了不影响目的蛋白的后续应用,都会选择一定的方式将表达时带上的各种标签去除。所以在设计构建载体时可以在标签蛋白和外源蛋白之间加上蛋白酶识别位点,这样表达纯化得到融合有标签的目的蛋白后通过蛋白酶切的方式将标签去除,得到完整的目的蛋白。这些常用的蛋白酶位点有:HRV 3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUMO蛋白酶切位点等。但是也有几点需要说明:

1.这些酶切位点特异性都比较高,但切割效率各不相同;

2.除了SUMO蛋白酶之外,其它常用蛋白酶切除标签后都会残留几个氨基酸残基。SUMO蛋白酶识别的是SUMO标签的空间结构,然后将这个标签完整切除,不会留下多余的氨基酸残基;

3.蛋白酶的切割效率也受识别位点附近的氨基酸残基性质的影响,具体可以参见有关文献;

4.有些标签比较小,免疫原性也很弱,一般不用切除,也不会对后续研究和应用产生影响,可以不必切除。但是有些大的标签,如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO标签等等,还是需要切除的。



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