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细胞冻存技术

(时间:2014-09-22 16:43  来源:未知   作者:zzhong   点击:次)
1.  原理
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低,并且提高细胞膜对水的通透性,在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。
2.  冻存液种类
  1. 传统细胞冻存液:新鲜培养基,含10%胎牛血清和5-10%DMSO
  2. 无血清快速冻存液:不含血清。通用于各种动物细胞株。不含动物来源性蛋白,能减少各类病毒、霉菌和支原体等污染,确保冻存细胞安全。含DMSO、葡萄糖等各种细胞营养成分、pH调节剂等成分。
3.  冷冻保存方法
(1) 传统方法:冷冻管置于4℃ 10分钟→-20℃ 30分钟→-80℃ 16-18小时(或隔夜)→液氮长期储存。-20℃不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡。
(2) 程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至-80℃以下,再放入液氮长期储存。
(3) 快速方法:细胞沉淀加快速冻存液,直接放入-80℃长期储存。
4.  操作步骤
(一)冻存
(1)冷冻前一日更换培养基,观察细胞生长情形。
(2)依细胞继代培养之操作,收集细胞,离心,去除上清液,加入适量冻存液,使细胞浓度为1~5×106/ml,混合均匀,分装于已标示完全的细胞冻存管中,依冻存液选择合适的保存方法。
(二)复苏
(1)准备容器,内装2/3杯37℃的温水。
(2)从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
(3)打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。
(4)1000rpm离心10分钟,弃去上清液。
(5)沉淀加10ml培养液,吹打均匀,再离心10分钟,弃上清液。(细胞数量少的情况下,复苏时可省略步骤5。)
(6)加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,第二天观察生长情况。
5. 无血清快速冻存液的优势
与传统的细胞冻存方法相比,无血清快速冻存液有以下几个特点:
  1. 不含血清和动物来源的蛋白  这有几方面的好处,一是降低了动物血清来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险,确保冻存细胞的安全。二是对于已经适应了无血清培养的细胞来说避免了血清的带入,同时避免了细胞生长状态的改变(如悬浮培养细胞回复贴壁状态),对于细胞培养者来说,避免了细胞复苏时再次进行无血清驯化工作,减少了人力和时间的浪费。三是动物血清成分复杂,个体差异大,且生产来源不稳定,因此批次间质量常常不稳定,这导致培养细胞的状态也会受到影响,因此,无血清培养和冻存已经成为发展趋势。无血清冻存液成分和配比明确,批次间差异很小,能够保证生长细胞状态的稳定性,细胞存活率高。
  2. 即用型  传统冻存方法需要用培养细胞相应的新鲜培养基,所以要根据细胞不同选择相应的培养基加保护剂,即需要现用现配,这就增加了工作量;而无血清快速冻存液已包含细胞冻存所需的所有成分,是即用型,方便快捷。
  3. 操作安全简便  传统方法冻存细胞需要进行梯度降温过程,耗时长,且需要保存于液氮中长期保存,这就增加了成本和工作人员的工作量,且从液氮中取细胞也不方便,容易冻伤,有一定危险性。液氮缺少容易造成细胞死亡。而无血清冻存液冻存细胞只需要-70~-80℃冰箱即可长期保存,冻存和复苏操作都很安全简单。
  4. 对冻存设备要求低  传统冻存方法因为要保存于液氮中,对冻存管材质及密闭性要求高,若有冻裂或液氮渗漏极容易出现爆裂,极容易造成重要细胞株的丢失和操作人员受伤;而无血清快速冻存对冻存管的要求低,可用普通材质的螺口管即可,安全可靠。
  5. 整板冻存  对于用细胞培养板培养的细胞,例如杂交瘤筛选过程,如果想要暂时保存整板克隆,用传统方法非常麻烦,且由于细胞数量少,操作过程会对细胞造成机械损伤,因此在复苏时细胞成活率很低;而用快速冻存液就可解决这个问题,只需直接丢弃整板培养液,加入适量快速冻存液,封闭培养板边缘,再置于-80℃冰箱即可,复苏时直接将培养板置37℃培养箱解冻后换新鲜培养基即可恢复培养,细胞状态几乎不受影响。适用于各种型号细胞培养板(如96孔、48孔、6孔、平皿等)。
 
 
 
 
 
附:传统冻存方法和无血清快速冻存方法比较
  传统细胞冻存方法 无血清快速细胞冻存法
安全性 动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险高 无动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险
冻存细胞种类 适合含血清细胞冻存 适合各类细胞冻存,尤其是无血清培养细胞
无血清培养细胞生长状态 易改变易由悬浮状态回复贴壁状态 保持悬浮培养状态
批次差异 批次差异大 无批次差异
操作方法 较复杂 简单快捷
保存设备 要求高(液氮) 要求低(低温冰箱)
操作安全性 低(易发生冻伤和爆裂)
微量冻存 细胞易死亡,存活率低 细胞存活率高
整板冻存 不可行 可行,且方便快捷